생리생화학실험실

전기영동(electrophoresis)의 원리는 다 아시는 바와 같이 시료를 gel에 심은 후 전기를 걸어서 시료의 각 성분이 크기에 따라
다르게 움직이는 성질의 차이로 분리하는 것입니다.

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Electrophoresis buffer solution

Electrophoresis를 할 때 gel이 잠기는 buffer solution에는 여러가지가 있으나 주로 TAE와 TBE가 많이
쓰입니다. TAE는 주로 agarose electrophorsis에, TBE 는 DNA sequencing에 쓰입니다. 조성은 다음과 같으며
대량을 쓰므로 미리 많이 만들어놓고 필요할 때마다 희석해서 부어서 씁니다.

Commonly used electrophoresis buffers

Buffer	Concentrated stock solution (per liter)
Tris-acetate (TAE)	50x 242 g Tris base 57.1 ml glacial acetic acid 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) Generally used for agarose EP
Tris-borate (TBE)	20x 121.1 g Tris base 61.7 g boric acid 7.44 g Na2EDTA-2H2O Generally used for DNA sequencing

Gel loading buffer

그리고 DNA 시료를 담는 loading buffer가 필요합니다. 이 buffer는 분자량이 큰 glycerol 등 무거운 물질이
함유되어 있어서 DNA가 든 시료를 gel 속에 잘 가라앉히고, 파란색을 내는 bromophenol blue가 들어 있어서
electrophoresis하는 동안에 현재 어느 정도 진행되어 있나 눈으로 보아 알 수 있게 해 줍니다. 다음과 같은 몇몇 종류가 쓰입니다.

Gel loading buffers (6x)

0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
40%(w/v) sucrose in water

II

0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
15% Ficoll(Type 400) in
water

III

0.25% bromophenol blue
0.25% xylene cyanol FF
30% glycerol in water

IV

0.25% bromophenol blue
40%(w/v) sucrose in water

Agarose gel 만들기

Agarose gel은 1%(w/v) 전후로 만듭니다. 우선 gel이 만들어지는 gel cast의 용량을 어림짐작해 봅니다. 보통 100
ml 정도입니다. 따라서 1%(w/v) 이라면, 1 g% = 1 g/100 ml입니다.
Gel cast가 100 ml 용량이라면 1 g의
agarose를 100 ml의 TAE buffer에 녹이면 됩니다. 사진과 같은 chemibalance에서 잰 다음 buffer를 넣고
플라스크에 넣고 가정에서 사용하는 것과 같은 전자렌지(microwave oven)에서 녹입니다.

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Agarose는 우리말로 한천입니다. 가루로 되어 있고 물에 녹지 않습니다. 그러나 용액(여기서는 electrophoresis에 쓰는
buffer solution) 속에 넣어서 전자렌지로 살짝 가열하면 오른쪽 사진처럼 녹아서 투명하게 됩니다. 몹시 뜨거워지므로 반드시 장갑을
끼고 플라스크를 잡아야 합니다.

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그 다음에는 agarose가 식어서 굳기 전에 재빨리 소량의 Etidium Bromide 용액을 넣고 플라스크를 흔들어서 골고루 섞이도록
합니다. 보통 0.5 mg/ml 짜리를 만들어 gel 에는 최종 0.5 ug/ml이 되게 넣습니다. 100 ml gel이라면 100 ul를
첨가합니다. Etidium Bromide는 모식도와 같이 DNA 이중나선의 사이에 끼어들어서 나중에 gel에 자외선을 쬐면 DNA에서 형광이
나와 눈에 보이도록 해 주는 역할을 합니다. Etidium Bromide는 DNA에 끼어드는 것으로 짐작할 수 있듯이 매우 위험한
발암물질입니다.

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만들어진 gel을 틀(gel cast)에 부어넣습니다. 틀은 플라스틱으로 되어 있고 comb을 꽂아서 시료를 넣을 공간을 준비해둡니다.

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약 15분 정도 지나면 gel은 굳어서 불투명하게 됩니다. 그러면 electrophoresis를 할 준비가 된 것입니다.

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Electrophoresis 하기

사진처럼 PCR product(즉, DNA 시료) 20 ul와 6x gel loading buffer 4 ul를 섞은 후 조심스럽게 gel
판에 comb으로 만들어진 홈에 집어넣습니다.

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아래 사진에 보이는 것은 electrophoresis에 필요한 직류전류를 걸어주는 장치입니다. 붉은 색이 양극, 검은 색이 음극 입니다.
거꾸로 꽂지 않도록 유의하세요.

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Bromophenol blue dye를 보면서 전기영동이 얼마나 되었는지를 판단하고, 이것이 gel 중간 쯤 갈 정도면 대개 적당한 정도가
되므로 gel을 꺼내서 사진과 같이 자외선을 내는 판 위에 놓습니다. 이 장비의 이름은 UV transilluminator입니다. 자외선을 쬐면
DNA가 있는 부분이 형광을 발하게 됩니다. Etidium Bromide가 끼어 들었기 때문이죠.

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UV transilluminator에서 보이는 gel의 모습은 아래 왼쪽과 같습니다. 오른쪽에 보이는 것은 폴라로이드 카메라 혹은 gel
document system으로 사진을 찍은 모습입니다. (같은 사진은 아닙니다.)

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PCR product purification

PCR product를 전기영동하면 product의 크기를 알 수 있습니다. 그러나 과연 원했던 sequence와 완전히 동일한가 아닌가는
이것으로는 알 수 없습니다.

이를 확실하게 증명하려면 DNA sequencing을 하여야 합니다. DNA sequencing을 하려면 우선 PCR한 DNA band를
정제(purification)하여야 합니다. 이 과정을 설명합니다.

기본 개념은 그림과 같이 PCR product를 직접 정제하거나 gel에서 DNA가 있는 부분을 오려낸 후 spin column을 사용하여
정제하는 것입니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/pcr_purification_01_concept.gif" width=483
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우선 날카로운 칼로 gel에서 PCR product가 있는 부분을 오려냅니다. 그러면 아래 사진과 같이 PCR product가 담긴 작은
gel 조각을 얻을 수 있습니다.

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이 gel 조각으로부터 DNA를 elution하는 여러 가지 kit가 있습니다. 어느 것을 쓰나 결과는 비슷한 것 같습니다. 대부분의
kit의 원리는 우선 6 M NaI와 같은 물질로 gel을 녹이고 이 용액에 포함된 DNA를 어떤 물질에 결합시킨 후 washing하고 마지막에
우려내는 것이라고 할 수 있습니다. 위 오른 쪽 그림은 gel을 녹이기 전과 녹인 후의 모습입니다.