생리생화학실험실

처음에 설명하였듯이, DNA 에서는 exon과 intron이 있으므로 DNA를 template로 하는 경우에는 exon과 intron이
모두 증폭될 수 있습니다. mRNA를 template로 하는 경우는 intron은 나오지 않겠지요. 그런데, intron은 exon에 비해서
대단히 큽니다. 따라서 exon 중에 몇 개를 한꺼번에 증폭하려면 DNA로는 힘듭니다. 더구나 intron sequence는 일부를 제외하고는
중요성이 떨어진다고 인식되어 밝히지 않은 것이 많아 GenBank에서도 찾을 수 없는 경우가 많습니다.

그것도 그렇지만 mRNA는 같은 genomic DNA에서 유래하였다고 해도 splicing 방법에 의해 변화된 것도 찾을 수 있고, 각
조직마다의 expression 정도를 찾기에도 이용되며, 무엇보다 coding sequence만 연결된 구조를 원할 때 쓰입니다.

돌연변이를 찾고자 할 때는 굳이 RNA를 template로 할 필요는 없겠지요. 돌연변이는 거의 DNA의 변화에서 오는 것이니까요.

RT-PCR

PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소(DNA-dependent DNA
polymerase)이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없습니다. 따라서 RNA를 template로 할 경우는 일단 DNA로 복사한 다음
증폭합니다. 그래서 RNA를 PCR하는 방법을 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain
Reaction)이라고 합니다. 이 경우는 앞에서 설명한 PCR을 시행하기 이전에 RNA로부터 DNA를 합성해 주는
효소(RNA-dependent DNA polymerase)인 reverse transcriptase를 처리하면 됩니다.

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맨 먼저 reverse transcriptase로 RNA를 complementary DNA(cDNA)로 역전사합니다. 이때 쓰이는
primer는 downstream primer뿐입니다. 왜냐하면 RNA는 single strand이기 때문입니다. 그후 생성된 cDNA에서
일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭합니다.

그러면 downstream primer는 어떻게 만들까요. 크게 다음과 같은 세가지 방법이 알려져 있습니다. mRNA 뒤에 poly(A)
tail이 붙는 것을 응용한 oligo(dT) primer, gene specific primer, 그리고 여기저기 붙는 random
primer입니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/rtpcr01_downstream_primer.gif" width=397
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Oligo(dT) primer를 쓰면 분리한 RNA 중 mRNA는 모두 cDNA로 만들어집니다. Gene specific primter를
사용하면 target gene만 cDNA로 만들어지겠지요. 그리고 random primer(주로 hexamer)는 염기서열이 일정치 않지만
길이가 고정된 primer입니다. 이런 primer를 넣고 반응시키면 길이도 다양하고 모든 RNA(rRNA, tRNA 포함)가 모두 cDNA로
만들어지겠지요. 즉 cDNA pool이 만들어지는 셈이죠. Random primer는 잘 안될 것 같지만 뜻밖에도 결과가 좋아서 현재 많이
쓰이는 방법입니다. 목적에 따라 다르겠지만, 처음 RT-PCR을 시도하는 것이라면 우선 random hexamer를 써보고 잘 안되면 다른 것을
try해 보시는 게 좋을 것 같습니다. Random hexamer를 주문할 때는 앞에서 설명한 primer 주문서에 5'-NNNNNN-3'
이라고 써서 주문하시면 됩니다.

RT-PCR의 반응은 다음과 같습니다.

cDNA 를 만드는 반응의 예

Total RNA	1 - 5 ug
Random hexamer or nonamer (100 ng/ul)	1 ul
10x reverse transcriptase buffer	2 ul
10 mM DTT	4 ul
10 mM dNTP	1 ul
Reverse transcriptase (250 units/ul)	1 ul
	water to 20 ul

70°C 10분	RNA denaturation
42°C 1시간	Reverse transcriptase reaction
80°C 15분	Enzyme killing