생리생화학실험실

Transformation(형질전환)이란 DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정을 말합니다.

Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때 다음과 같이 조금 다른 용어를 사용합니다. 이 실험에서는
prokaryote인 E.coli를 사용하므로 'transformation'을 하는 것입니다.

Cell	DNA	Term
Prokaryote	Plasmid Bacteriophage (virus)	Transformation Infection
Eukaryote	Plasmid Virus vector	Transfection Transfection

Chemical method
    - Calcium phosphate를 이용한
방법
    - Liposome을 이용한 방법
Physical
method
    - Electroporation
    -
Microinjection
Virus를 이용한 방법
    -
Retrovirus
    - Adeno or adenoassociate virus

Competent cell 이란 

Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미합니다.
화학처리에 쓰이는 시약은 다음과 같이 여러가지가 있으며 이 중 가장 중요한 것은 calcium chloride입니다.

• Calcium Chloride
  
• Manganase Chloride
  
• Hexamminecobalt Chloride
  
• Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

Competent cell을 이용한 transformation의 과정은 다음 모식도와 같습니다. CaCl₂로 처리하여
competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 됩니다. Heat shock을 가하면 plasmid 가 cell
안으로 들어가는 효율을 증가시킬 수 있습니다. 이제 이 과정을 차례차례 사진과 함께 설명하겠습니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_02_concept.gif" width=368
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Competent cell 의 제조방법

Calcium chloride를 이용한 competent cell의 대표적인 제조방법은 다음과 같습니다.

1. LB plate에 자란 DH5 alpha colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키웁니다.
   
2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.₆₀₀이 0.4가 될 때까지
   37°C shaking incubator에서 키웁니다.
   
3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둡니다.
   
4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리합니다.
   
5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl₂ 용액을 원래의 1/2 부피로
   넣고 부유시킵니다.
   
6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000∼4,000 rpm으로 10분간 원심분리합니다.
   
7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl₂ 용액으로 부유시킵니다.
   
8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 ul씩 분주하고, 사용할 때까지 deep
   freezer에 보관합니다.

위 방법은 사실 가장 간단한 방법으로, 최근에는 잘 쓰지 않습니다. Transformation의 효율을 높이기 위하여 사람들이 여러 방법을
modify해서 쓰고 있는데, 예를 들어 어떤 물질을 첨가한다든지, 균을 낮은 온도에서 키운다든지 하는 방법입니다.

효율이 더 높은 방법을 원하시면 이 홈페이지의 워크샵 교본 href="http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/bacterial_transformation.php#B. Competent cell의 제조"
target=_blank>[박테리아의 형질전환] 편을 참고하시기 바랍니다.

Competent cell은 사진에서처럼 -70°C 냉동고 속에 보관하다가 필요할 때마다 꺼내어 씁니다. Gene cloning의 필수
요소인 competent cell 정도는 남에게 얻어 쓰지 말고 스스로 만들어서 쓰는 게 좋겠습니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_03_samples.gif" width=339
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Transformation 과정

Transformation은 비교적 간단합니다. Competent cell을 하나 꺼내어 녹인 다음, 준비해 왔던 DNA ligate를
섞어서 얼음에 30분 두고, 이어 42°C에서 90초간 heat shock을 준 다음에 배지에 깔면 되는 것입니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_03_cold_and_heat.gif" width=285
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균 용액을 이제 항생제가 포함된 고체 LB 배지에 얇게 펴서 바릅니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_03_spread.gif" width=317
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간단하지요  그러나 지금부터 어려워집니다. 위와 같은 기본 실험 방법에서 고려되고 있는 몇가지 사항이 있거든요. 그것이 바로
selection의 개념입니다.