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3-1. Transformation
작성자 안홍선
날짜 2009.05.12
조회수 18,822
Transformation의 개념

Transformation(형질전환)이란 DNA를 bacteria 세포 내로 주입하는 과정을 말합니다.

Prokaryote와 eukaryote에서는 DNA를 세포 내로 주입할 때 다음과 같이 조금 다른 용어를 사용합니다. 이 실험에서는
prokaryote인 E.coli를 사용하므로 'transformation'을 하는 것입니다.



















Cell DNA Term



Prokaryote Plasmid
Bacteriophage (virus)
Transformation
Infection
Eukaryote Plasmid
Virus vector
Transfection
Transfection




참고로 eukaryote에서 DNA를 세포 내로 주입하는
transfaction 방법에는 다음과 같은 것들이 있습니다. 각자 장단점이 있습니다.

Chemical method
    - Calcium phosphate를 이용한
방법
    - Liposome을 이용한 방법
Physical
method
    - Electroporation
    -
Microinjection
Virus를 이용한 방법
    -
Retrovirus
    - Adeno or adenoassociate virus


Competent cell 이란 


Competent cell이란 정상적인 bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미합니다.
화학처리에 쓰이는 시약은 다음과 같이 여러가지가 있으며 이 중 가장 중요한 것은 calcium chloride입니다.


  • Calcium Chloride
  • Manganase Chloride
  • Hexamminecobalt Chloride
  • Dimethyl Sulfoxide (DMSO)

Competent cell을 이용한 transformation의 과정은 다음 모식도와 같습니다. CaCl2로 처리하여
competent cell로 만들면 plasmid가 cell에 들어갈 수 있게 됩니다. Heat shock을 가하면 plasmid 가 cell
안으로 들어가는 효율을 증가시킬 수 있습니다. 이제 이 과정을 차례차례 사진과 함께 설명하겠습니다.


src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_02_concept.gif" width=368
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Competent cell 의 제조방법

Calcium chloride를 이용한 competent cell의 대표적인 제조방법은 다음과 같습니다.


  1. LB plate에 자란 DH5 alpha colony를 LB 배지 2 ml에 접종한 후 밤새 키웁니다.
  2. 위에서 키운 배양액 1 ml을 100 ml LB 배지가 담긴 플라스크에 넣고 O.D.600이 0.4가 될 때까지
    37°C shaking incubator에서 키웁니다.
  3. 배양액을 50 ml conical tube에 넣고 얼음에 10분간 놓아둡니다.
  4. 4°C에서 4,500 rpm으로 10분간 원심분리합니다.
  5. 상층액을 완전히 제거한 후 미리 차게 해 둔 0.1 M filtered CaCl2 용액을 원래의 1/2 부피로
    넣고 부유시킵니다.
  6. 얼음에 15분 놓아두었다가 다시 4°C에서 3,000∼4,000 rpm으로 10분간 원심분리합니다.
  7. 상층액을 버리고 처음의 1/10 부피의 filtered CaCl2 용액으로 부유시킵니다.
  8. 얼음에 30분 놓아두었다가 미리 차게 해둔 microfuge tube에 200 ul씩 분주하고, 사용할 때까지 deep
    freezer에 보관합니다.

위 방법은 사실 가장 간단한 방법으로, 최근에는 잘 쓰지 않습니다. Transformation의 효율을 높이기 위하여 사람들이 여러 방법을
modify해서 쓰고 있는데, 예를 들어 어떤 물질을 첨가한다든지, 균을 낮은 온도에서 키운다든지 하는 방법입니다.


효율이 더 높은 방법을 원하시면 이 홈페이지의 워크샵 교본 href="http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_workshop/bacterial_transformation.php#B. Competent cell의 제조"
target=_blank>[박테리아의 형질전환]
편을 참고하시기 바랍니다.


Competent cell은 사진에서처럼 -70°C 냉동고 속에 보관하다가 필요할 때마다 꺼내어 씁니다. Gene cloning의 필수
요소인 competent cell 정도는 남에게 얻어 쓰지 말고 스스로 만들어서 쓰는 게 좋겠습니다.


src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_03_samples.gif" width=339
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Transformation 과정


Transformation은 비교적 간단합니다. Competent cell을 하나 꺼내어 녹인 다음, 준비해 왔던 DNA ligate를
섞어서 얼음에 30분 두고, 이어 42°C에서 90초간 heat shock을 준 다음에 배지에 깔면 되는 것입니다.


src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_03_cold_and_heat.gif" width=285
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균 용액을 이제 항생제가 포함된 고체 LB 배지에 얇게 펴서 바릅니다.


src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_03_spread.gif" width=317
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간단하지요  그러나 지금부터 어려워집니다. 위와 같은 기본 실험 방법에서 고려되고 있는 몇가지 사항이 있거든요. 그것이 바로
selection의 개념입니다.