생리생화학실험실

Insert가 존재하면 99% 원하는 DNA가 맞습니다. 그러나, 일단 방향은 모르고 같은 크기의 다른 DNA가 들어있을 가능성도
없다고 할 수 없습니다(방향성은 제한효소로 알 수 있기는 합니다). 어쨌든 gene cloning과 subcloning의 마지막에는 반드시
DNA sequencing으로 염기서열의 일부라도 확인해야 합니다.

하루에도 수백편씩 쏟아져 나오는 논문들의 "materials and methods" 부분에서 DNA를 어떻게 준비했는지를 설명한 부분을
찾아보면 거의 대부분 다음과 같은 말이 씌어 있습니다.

"The sequences of the clones are confirmed by DNA sequencing in
both directions."

Cloning을 통해 얻어낸 DNA는 반드시 염기서열을 sequencing하여 확인하여야
합니다. DNA sequening 방법은 Sanger's dideoxy (enzymatic) method입니다. 노벨상을 타낸 실험기법입니다.
Sanger라는 분은 노벨상을 두번이나 수상한 대단하신 분이죠.

최근 몇 년 전부터 DNA sequencing을 대행해주는 업체가 많이 생겼습니다. DNA와 primer만 주면 한 건당 20,000원
내외에서 대행해줍니다. 이들 업체들은 automatic sequencer를 이용합니다. 이를 이용하면 보다 대량의 샘플을 비교적 짧은 시간에
수행할 수 있습니다. 그러나 이런 기계들도 모두 Sanger의 방법을 이용하는 것이라고 할 수 있습니다. 따라서 이 과정을 이해하는 일이
중요하겠습니다.

이제 Sanger's method를 설명하겠습니다.

Sanger's dideoxy (enzymatic) method

DNA sequencing을 하는 여러 kit가 있어서 조금씩 방법은 다릅니다만 원리는 같습니다. 여기서는 모 회사 T7
sequencing kit 를 사용한 방법을 설명합니다.

width=498 border=0>

첫 단계는 DNA를 denature하는 과정입니다. NaOH를 써서 변성시킨 후 ethanol로 급격히 침전시키면 denature 상태의
plasmid DNA를 얻을 수 있습니다.

width=437 border=0>

여기에 sequencing primer를 넣어 annealing 시킵니다. Sequencing primer는 위 그림처럼 template가
되는 plasmid DNA에 annealing 할 수 있는 primer를 쓰면 되는데, 대개는 vector의 MCS 양쪽에 있는 부위에 붙을 수
있는 primer를 씁니다. 그러면 insert가 다양해도 단 두 개의 primer만 있으면 모두 양방향으로 sequencing 할 수
있으니까요.
MCS의 양쪽에는 SP6, T3, T7 promoter 처럼 virus origin의 promoter가 달려있다는 말씀을 드린
적이 있는데, 대개는 이 부위에 붙을 수 있는 primer를 합성하여 SP6, T3, T7 primer라고 부릅니다. Promoter 중에서
primer의 위치가 전세계적으로 통일되어 염기서열이 같습니다. 팔기도 합니다.

width=482 border=0>

여기서 동위원소와 나머지 dNTP를 넣고 효소를 넣어주면 새로운 DNA 가닥이 합성됩니다. 이 과정은 새로 합성되는 모든 DNA
strand를 동위원소로 표지하기 위한 과정입니다. 따라서 반응을 조금 억제해서 너무 길게 합성이 되지 않아야 합니다. 위와 같이 dNTP를
낮은 농도로 넣고 반응도 상온에서 시행하도록 조건을 맞춥니다.

width=440 border=0>

이제 동위원소로 표지된 모든 strand가 dideoxy NTP(ddNTP)에 의해서 반응이 중지되거나 아니거나 하도록 하는 과정을
시행합니다.

DNA strand가 합성되려면 반드시 3'-OH가 노출되어 있어야 하는데, ddNTP가 들어간 부분은 3'-H 로 되어 있게 되므로 더
이상 합성이 일어나지 않고 끝나게 됩니다. dNTP가 들어가느냐 ddNTP가 들어가느냐에 따라서 합성이 계속되거나 중지되거나 하는 것입니다.
반응의 조건을 맞추면 모든 경우의 수가 다 발생하여 위 그림에서처럼 G로 끝나는 자리에서 ddCTP가 들어가 반응 중지된 모든 strand를
얻을 수 있습니다.

width=651 border=0>

이처럼 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP가 들어있는 네 tube에서 각각의 반응을 시행시키면 각 tube에는 특정한
염기서열로 끝나는 모든 종류의 DNA strand가 존재하게 됩니다. 예를 들어 위 그림에서 ddATP를 넣은 tube에서 반응시키면 tube
속에는 모두 ddATP로 끝난 반응물이 생기게 되며, 이때 그 길이에 해당하는 원래 DNA(template)의 염기 서열은 T임을 알 수
있습니다.

width=525 border=0>

이를 전기영동합니다. 전기영동은 7 M urea가 포함된 8% acrylamide gel에서 합니다. 뒤에서 설명할 것처럼, 이 gel은
두께가 매우 얇고 acrylamide의 특성상 하나의 염기 차이가 있어도 이동거리가 달라져 크기를 구별할 수 있게 되어 있습니다. 물론
전기영동시에는 template를 떨어뜨려 denature 상태로 전기영동하여 single strand의 크기 차이로 구별합니다. 앞에서 반응시킨
네 개의 tube를 각각 전기영동시키면 위와 같은 그림을 얻을 수 있고 그 염기 서열을 읽을 수가 있게 되는 것입니다. 대단하죠! 과히 노벨상을
받을 만한 천재적인 발상이었습니다.

 

DNA sequencing 실험 과정

border=0>

모 회사에서 나오는 T7 sequencing kit의 사진입니다. 물론 kit에 동위원소는 들어 있지 않습니다. 당연히 따로 구입해야
하죠.

border=0>

DNA sequencing gel의 모습입니다. TV에서 실험실을 소개할 때 많이 나옵니다. 어디서 많이 본 것 같죠  이 DNA
sequencing gel은 분자생물학 실험실의 상징처럼 된 것 같습니다.

DNA sequencing gel

DNA sequencing gel은 다음과 같이 준비합니다. Urea, acrylamide 용액, TBE, 증류수를 섞어 잘 녹인다음
여과지로 한 번 거르면 됩니다. Gel cast를 모두 준비한 다음에 ammonium persulfate와 TEMED를 넣으면 굳기 시작합니다.
DNA sequencing gel은 한 base 차이를 구분하고 해상도를 높이면서 denaturing 상태를 유지하기 위한 다음과 같은 특성이
있습니다.

• 7 M Urea, 8% Acrylamide, TBE buffer
  
• Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)
  
• Long distance(40 cm) and thin(0.35 mm)
  
• High voltage electrophoresis(2,000 volts)

Urea, formamide, formaldehyde와 같은 시약은 DNA의 Tm 값을 낮추는 시약들입니다. 이 시약이 들어간 상태에서
2,000 volts 전기영동을 하게 되면 gel이 약 55°C 정도로 heating되면서 DNA가 denaturation 상태로 내려갑니다.

          Sequencing Gel
Mix

Urea	42 g
40% (38:2) Acrylamide : bisacrylamide	20 ml
20x TBE	5 ml
Water to 100 ml
30% Ammonium persulfate	260 ul
TEMED	75 ul

다음과 같이 Urea를 넣고 나머지를 넣어 녹입니다. 오른쪽이 다 녹고 filter한 모양입니다. 옆의 작은 tube에 ammonium
persulfate가 있고 그 옆에 TEMED 용액이 보입니다.

border=0>

Gel cast는 사진과 같이 준비합니다. 두 장의 유리 사이에 0.3 mm 의 spacer 로 분리된 아주 얇은 공간이 마련되어
있습니다. 이 사이로 gel 을 부은 다음 굳혀야 하는 것입니다.

border=0>

Squeezing bottle(일명 쭉쭉이)에 gel 용액을 넣고 ammonium persulfate와 TEMED를 넣습니다.

border=0>

Gel 판을 들고 용액을 유리 사이로 쏘아 넣습니다. 희미하게 gel이 들어가고 있는 것을 알 수 있습니다. 최근에는 automated
sequencer가 많이 보급되어서 이렇게 manual sequencing gel을 이용한 방법을 그다지 많이 쓰지는 않지만, 이런 gel은
SSCP, DNase I footprinting 실험 등 다른 실험에서도 사용할 수 있으므로 실험실에서 꽤 많이 만드는 gel입니다. 이
gel을 만드는 것은 보기보다 상당히 어려워서 기포가 없는 깨끗한 gel을 만들려면 연습을 여러번 많이 해야 합니다.

border=0>

Gel을 모두 붓고 나면 상단에 flat comb을 설치합니다.

border=0>

나중에 flat comb을 제거하면 아래와 같이 긴 네모난 공간이 생깁니다. 여기에 그림과 같이 shark tooth comb(상어 이빨
모양)을 설치하여 생긴 공간에 반응물을 apply하게 됩니다.

border=0>

Shark tooth comb을 쓰는 이유는 이것을 씀으로써 각 lane 사이의 거리가 없어지기 때문에 DNA의 크기 차이를 쉽게 비교할
수 있기 때문입니다.

Gel이 모두 굳으면 clip을 제거하고 flat comb을 제거한 다음 gel을 설치하고 shark tooth comb을 설치합니다.

border=0> border=0>

모두 준비된 모습입니다. 이렇게 Shark tooth comb 을 알맞은 깊이로 꽂는 것도 많은 연습이 필요합니다.

border=0>

앞에서 설명한 바와 같이 반응을 진행하여 얻은 네 개의 tube입니다. 반응의 마지막 단계는 stop solution을 넣는 것이었는데,
이 stop solution에는 formamide와 dye가 들어 있습니다. Dye는 agarose gel에서 설명한 바와 같이 전기영동을
눈으로 확인하기 위한 것입니다.

border=0>

앞에서도 설명했지만, DNA sequencing 전기영동은 DNA 를 denature 시키고 single strand 상태로 전기영동이
되어야 합니다. 이를 위해 필요한 조건들은 다음과 같습니다.

1. sample에 넣어준 formamide
   
2. gel에 들어있는 urea
   
3. apply하기 전에 sample을 80도 이상으로 2분 정도 가열
   
4. 2,000 volt의 고압에 의한 heat

이러한 조건이 갖추어져야 single strand를 유지하면서
전기영동되는 것입니다.

border=0>

border=0>

Sample을 apply하는 광경입니다. Sample은 신속하고 정확하게 apply합니다. 이렇게 DNA sequencing gel에
sample을 apply하는 모습은 참 멋있는 장면인 것 같습니다.

4개씩 분리하여 apply한 모습입니다. 이렇게 하면 나중에 4개의 sample간의 간격은 없게 됩니다. 그것이 shark tooth
comb의 역할이지요.

border=0>

옆에 있는 고압 power supply를 이용하여 전기영동합니다.

border=0>

DNA sequencing 시에는 sample을 apply하지 않은 상태에서 먼저 1800 volt로 약 15분 정도 pre-run을 하여
gel의 온도를 높여 놓습니다. 그림에 보이는 황색 열판이 gel 뒷면에 있어서 gel의 온도를 골고루 올려줍니다. 이렇게 해서 얻어지는
gel의 온도는 약 55도 정도입니다. 이 정도 온도가 되면 formamide와 urea가 존재하는 상태에서 Tm 값이 많이 낮아지기 때문에
DNA denaturation에 충분한 조건이 됩니다.
Sample을 apply한 후에는 2000 volt, 15 ~ 35 mA로
전기영동합니다.

border=0> border=0>

Dye의 움직임을 보고 전기영동을 마칩니다. 대개 앞서 나가는 bromophenol blue가 gel의 밑바닥에 다다르면 전기영동을
끝냅니다. 그 다음 gel 판을 해체하고 눕혀 한쪽 면의 유리를 제거합니다.

border=0> border=0>

한쪽 면에 유리가 붙어있는 상태로 5% methanol/5% acetic acid 용액에 soaking합니다. 이 과정은 gel에 있는
urea를 제거함과 동시에 DNA를 그 위치에 fixing하는 단계입니다. Urea가 제거되지 않으면 나중에 gel을 말릴 때 곤란함을 겪게
됩니다. 이 상태로 15분 정도 놓아둔 후 용액에서 꺼내고 gel 위에 3MM filter paper를 얹습니다.

border=0> border=0>

유리에 붙어있던 gel이 3MM paper로 옮겨 붙도록 합니다. 3MM paper를 덮었을 때 그 위로 신문지를 덮고 물기를 잘 제거하면
이렇게 옮겨 붙게 됩니다. 많은 연습이 필요한 단계입니다.
오른 쪽 사진에 보면 얇은 gel 이 3MM paper에 잘 옮겨붙어 있습니다.
그런데 지금 Gel은 젖은 상태라서 이대로는 X-ray film에 노출시키기 곤란합니다.

border=0> border=0>

그래서 나오는 것이 gel drier라는 장비입니다. 여기에 gel을 넣고 80°C 정도로 가열하면서 진공을 걸어 gel을 바짝 말립니다.

border=0>

다 마른 gel을 X-ray cassette에 넣고 위와 같이 X-ray film을 넣은 다음 cassette를 덮어 적어도 하루밤 정도
노출시킵니다. 이 과정은 암실에서 진행해야 합니다.
동위원소 중 S³⁵를 쓰는 경우에는 상온에 방치하면 되고 그림에서
보이는 cassette 내부의 양쪽 하얀 판이 불필요합니다. 이 판을 intensifying screen이라고 부르는데,
P³²를 쓰는 경우에 필요한 판입니다. P³²를 쓸 때 -70°C에 넣어 두면 이 판의 도움을 받아서
signal이 더 뚜렷해지는 효과가 있습니다.

요즘은 image analyzer system이란 장비가 있어서 X-ray film이 아닌 phosphoimaging plate라는 판에
노출을 시킨 다음 컴퓨터로 읽어서 분석하기도 합니다. 이런 쪽은 점점 첨단화해서 옛 방식이 금방금방 불편해집니다.

 

실험 결과

border=0>

X-ray film을 현상하면 위와 같은 사진을 얻습니다. 맨 처음 계획했던 자궁경부암 환자의 경우를 예를 들면 정상과 비교하여 단 하나의
염기서열이 바뀐 것을 눈으로 확인할 수 있습니다. GenBank 염기 서열과 비교하여 변화될 아미노산도 예측할 수 있으며, 이것을 p35의
구조와 연결시키면 그 significance도 짐작해 볼 수 있습니다. (사진이 아마 p53의 것은 아닐 겁니다. 아무 sequencing
결과나 집어서 컴퓨터로 제가 만든 것이니까요. 이런 식으로 나온다는 것만 보여드리고 있습니다.)

이 경우에서는 정상적인 아미노산인
arginine이 cystein으로 바뀌게 되는데, 이 부분이 p53의 기능상 중요한 부분이므로 돌연변이 p53 단백질은 크기는 정상이라도
기능을 하지 못합니다.

border=0>

이 그림은 automated DNA sequencing의 원리에 관한 것입니다. 반응은 앞서 설명한 것과 비슷합니다. 방사선 대신 형광
물질을 이용하고, 여기서 나오는 signal을 컴퓨터로 분석하여 염기서열을 읽어주는 것입니다. 몇몇 실험실에서는 유료로 automated
sequencing 을 대행합니다. Automated sequencing은 manual sequencing에 비해 가격은 비싸지만, 한번에 보다
많은 염기를 정확하게 읽을 수 있는 장점이 있습니다.