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4-2. Restriction enzyme mapping
작성자 안홍선
날짜 2009.05.12
조회수 3,852
Restriction enzyme mapping

분리한 DNA를 제한효소로 처리하여 원하는 DNA가 삽입되어 있는지를 확인합니다. 이 실험처럼 T-vector를 이용한 경우에는 DNA
insert는 EcoRV 효소 위치에 삽입되게 됩니다. 따라서 그 가장자리에 존재하는 효소로 처리하면 insert의 존재 여부를 알 수
있습니다.


src="http://dkbiophysi.pulun.net/plasmid_dna_isolation_05_1.gif" width=278
border=0>
src="http://dkbiophysi.pulun.net/plasmid_dna_isolation_05_2.gif" width=348
border=0>


 


사실 restriction mapping이라는 것은 염기서열을 모르는 DNA에서 어느 부분에 어떤 제한효소로 잘리는 부위가 있는지를
결정해서 그 DNA의 대략적인 모습을 나타내는데에 의의가 있는 것입니다. 말 그대로 "지도"를 작성하는 것이지요. 우리가 생판 모르는 거리에서
산과 강, 빌딩을 표시하면 찾아갈 수 있는 것과 같습니다.


이 실험에서는 우리가 DNA의 염기서열을 알고 있기 때문에 제한효소를 처리하면 우리가 원하는 DNA가 맞는지를 확인하는 목적으로
사용합니다.


반응의 예를 들면 다음과 같습니다.



















Plasmid DNA about 1 ug
10x buffer 2 ul
EcoRI 5 unit
HindIII 5 unit



water to 20 ul, 37°C,
1시간


위 그림에서 보면 알 수 있듯이 p53 내부에는 이런 제한효소 절단부위가 없기 때문에 vector의 양쪽만 잘리게 되어 PCR
product 부위(insert)와 vector가 분리될 것입니다. 양쪽이 모두 존재하고 크기가 예상한 것과 같으면 거의 99% 원하는
DNA라고 볼 수 있습니다.


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위 그림에서 맨 왼쪽(lane 1)은 우리가 크기를 알고 있는 size marker입니다. 2, 3, 4번 lane 중에서 2, 3번에서
insert가 보이는군요.

때로는 아래와 같이 well에 걸린 chromosomal DNA, RNA 등이 같이 보이기도 합니다. 모두 분리 과정에서 깨끗하게 하지
못했기 때문인데, 이런 경우에는 제한효소의 활성이 떨어져 판독하기가 꽤 어려워지게 됩니다. 그러므로 제한효소 처리는 신중하게 하여야
합니다.


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사진에서 보듯이 마지막 5개 lane의 DNA는 우리가 원하는 것임을 알 수 있습니다. 그러나 처음에 말했듯이 나머지 것들 중에는 해석이
그다지 가능하지 않은 이상한 것들도 보이는군요. Color selection을 했음에도 불구하고 self-ligate가 발견되는 일은 아주 흔한
일입니다.


이렇게 insert가 존재하면 원하는 DNA라고 볼 수 있을까요  만약 크기는 같고 염기서열은 엉뚱한 것이라면 


자, 그럼 다음은 gene cloning의 대단원, DNA sequencing입니다.