생리생화학실험실

주로 miniprep이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법입니다. 여러가지 방법이 있지만, 여기서는 가장
보편적으로 사용되는 방법인 Alkali lysis method를 소개합니다.

기본적인 원리는 그림에서 보듯이 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것입니다.

이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것입니다. 이 둘은
모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않습니다. 다행히 chromosomal DNA는 분리 과정에서 linear
형태가 되고 크기가 상당히 크기 때문에 이런 성질의 차이를 이용하면 분리할 수 있습니다.

Alkali lysis method 의 핵심 원리는 다음과 같습니다.

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1. 세포벽을 깹니다. 이 때 세포막은 유지되도록 합니다. 세포벽을 군데군데 무너뜨리는 물질은 EDTA이며, 이때 sucrose나
glucose가 첨가되어 세포의 형태를 유지하도록 합니다. 때로는 lysozyme을 쓰기도 합니다.

2. 세포막을 조심스럽게 깨서
크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각나는 것을 방지하면서 용액에 DNA 를 노출시킵니다. SDS라는 detergent가
세포막을 녹여버리면서 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나오게 됩니다. 이때 바로 alkali 용액에 노출된 DNA는 모두 denature
됩니다. 그러나 크기가 작은 supercoiled plasmid DNA는 그다지 심각하게 되지 않는 성질을 이용하는 것입니다.

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3. pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적
renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 됩니다. 이렇게 엉긴
chromosomal DNA를 원심분리로 제거합니다. 그러면 상층액에 plasmid DNA가 있게 됩니다.

Plasmid 분리에 사용하는 시약

위와 같은 원리를 적용하기 위해서 실제 실험에서는 실험에 세 가지 종류의 시약을 사용합니다.

Solution I

• 50 mM glucose
  
• 25 mM Tris-Cl, pH 8.0
  
• 10 mM EDTA

EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을
제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 합니다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 줍니다. 뒤에서 설명하겠지만, 이
과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid
DNA와 구분할 수 없게 됩니다. 따라서 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것입니다.

Solution II

• 0.2 N NaOH
  
• 1% SDS (sodium dodecyl sulfate)

SDS는 ionic detergent로 세포막을
깨는 일을 합니다. NaOH는 DNA를 denaturation시킵니다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게
처리합니다.

Solution III

• 5 M potassium acetate, glacial acetic acid

Renature시키는
산성용액입니다. 이렇게 해서 Chromosomal DNA는 SDS와 potassium과 함께 엉기게 됩니다.

세균에서 plasmid DNA를 분리하려면 먼저 세포를 많이 키워야 합니다. 배양접시에 자란 colony를 멸균한 이쑤시개로
picking하여 액체 배지에 키웁니다. 이 액체 배지에는 ampicillin이 함유되어 있습니다.

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자세히 보면 액체배지에 균이 묻어있는 이쑤시개가 담겨 있습니다. 이 액체배지를 37°C 배양기에서 흔들면서 하룻밤 동안
키웁니다(shaking incubation). 사진에서는 red rotor를 쓰고 있는데, 실제로는 shaking incubation 전용으로
쓰는 shaking incubator가 따로 있습니다. 어쨌든 aeration을 위해서 흔들면서 키워야 합니다.

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왼쪽이 균이 자라서 뿌옇게 된 액체배지이며, 오른쪽은 키우기 전의 배지입니다. 균이 가득 자란 액체배지 1.5 ml를 microfuge
tube에 옮겨 담고 5분간 상온에서 12,000 rpm으로 원심분리합니다. 그리고 상층의 배양액을 제거합니다. 균 침전물을 확인할 수
있습니다.

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이제 침전된 균 덩어리를 solution I, II, III로 차례로 처리합니다. 이 세 가지 용액은 모두 무색 액체인데, 어떤 사람들은
solution I에는 RNaseA를 넣어서 쓰기도 합니다. Solution I, III는 냉장 보관합니다. Solution II는 공기에
노출되면 NaOH 농도가 떨어지므로 가능한 공기 노출을 피하고, 오래된 용액을 사용하지 않도록 합니다.

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침전된 균에 solution I을 200 ul 넣고 vortex하여 균을 풀어줍니다. 뭉쳐진 균을 이렇게 풀어주어야 solution II가
모든 세균에 균일하게 처리될 수 있기 때문에 뭉쳐진 곳 없이 확실히 풀도록 합니다. 이 vortex 과정이 있기 때문에 세포막을 깨지 않고
세포의 형태를 유지하려고 애쓴다는 것을 앞에서 설명하였습니다.

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왼쪽이 vortex하여 액체 안에 풀어진 세균의 모습입니다. 이에 solution II를 200 ul 넣고 5 ~ 6회 가운데 사진과 같이
inverting하여 섞습니다. 절대 심하게 섞어서는 안됩니다. Solution I, II, III의 비율은 전통적으로 1:3:2로 씁니다만,
1:1:1로 하면 양은 좀 적어도 더욱 정제된 plasmid를 얻을 수 있는 것 같습니다.
Solution II를 넣으면 세포막이 깨져
세포 내용물이 용액으로 흘러나오면서 용액은 투명해집니다. 또 chromosomal DNA가 용액으로 흘러나오면 점도가 매우 높아져서
끈끈해집니다. 만약 투명하지 않은 부분이 있다면 균이 아직 덜 깨진 증거인데, 이를 방지하기 위해서 solution I을 넣었을 때 철저히 균을
풀어주어야만 합니다. 때로는 균에 비해서 용액이 너무 적어서 안풀리는 경우가 있는데, 경험적으로 200:200:200, 또는 균이 많으면
300:300:300을 쓰도록 합니다.
Solution II를 넣은 후 5분간 상온에서 방치하되, 균이 완전히 깨져 투명해지면 다음으로
바로 넘어가도 좋습니다. 5분 이상 두면 plasmid DNA도 renature되기 힘들어진다고 하므로 너무 오래 두지 않도록
합니다.
오른쪽 사진은 solution II에 의해 투명해진 모습입니다.

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Solution III를 200 ul 넣으면 위와 같이 하얀 침전물이 생기는데, 이것이 chromosomal DNA 및 potassium,
SDS의 complex라고 생각하시면 됩니다. 너무 뭉쳐있으면 안되므로 하얀 침전물을 적당한 충격으로 조금 풀어줘서 하얀 눈꽃송이 모양이 되도록
합니다. 몇번 뒤집으면서 살살 흔드는 것으로 충분합니다. 이후 얼음속에 10분간 방치합니다.

아래는 Solution I, II, III를 순차적으로 처리하면서 변해가는 시료의 모습입니다

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4°C에서 15,000 rpm, 10분간 원심분리한 다음 상층액을 조심스럽게 떠서 새 튜브에 옮깁니다. 이 상층액에 plasmid DNA가
들어 있습니다. 침전물은 chromosomal DNA이므로 상층액에 딸려오지 않게 주의합니다.

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새 원침관에 옮겨진 상층액에 같은 양의 isopropyl alcohol을 넣고 5 ~ 6회 뒤집어서 잘 섞은 다음 상온에 20분
방치합니다. 이는 DNA를 침전시키는 역할을 합니다. 오른쪽 사진과 같이 무색이면서도 뭔가 뿌연 듯한 용액이 됩니다.

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DNA는 적당한 salt 농도와 적당한 alcohol 농도 하에서 침전됩니다. DNA 침전에 쓰이는 조건들은 다음과 같습니다.

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Ethanol : 2 ~ 2.5 volume

• final 0.3 M sodium acetate, pH 5.2 :
  
  
  
  • commonly used
  
  
• final 0.2 M sodium chloride
  
  
  
  • DNA containing SDS
  
  
• final 2 M ammonium acetate
  
  
  
  • triphosphate removal
    
  • inhibits T4 polynucleotide kinase and TdT
  
  
• final 0.8 M lithium chloride
  
  
  
  • RNA precipitation, very soluble in ethanol
    
  • inhibits reverse transcription

Isopropyl alcohol : equal volume

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일반적으로 DNA를 침전시켜 농축시킬 때는 위와 같은 alcohol 침전법을 많이 사용합니다. 주로 ethanol이 많이 쓰이며, 알콜
침전시에는 monovalent salt ion(sodium 이나 potassium 등)이 필요한데, 위와 같이 여러가지를 쓸 수 있으며 목적에
따라서 골라서 씁니다. 예를 들어 전단계까지 SDS를 쓴 경우는 용액에 SDS가 들어 있으므로 NaCl을 salt로 쓰는 것이 좋습니다.
일반적으로는 sodium acetate와 ethanol의 조합을 가장 많이 씁니다.

원심분리(15,000 rpm, 4°C, 10분)하여 상층액을 완전히 제거합니다. 하얀 침전물이 DNA입니다. 여기에 약간의 단백질과
RNA가 그대로 섞여 있을 수 있습니다.

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침전물이 보입니까  이렇게 쥐꼬리만한 거 가지고 어떻게 실험하느냐는 말들을 하지요. 쪼잔하다면서요. 하지만, 이 세계는 이렇듯
"마이크로"의 세계입니다.

이제 침전물을 TE, pH 8,0 용액에 녹입니다. 이 때 RNase A를 함께 넣어 처리하면 좋습니다. RNase A는 20 ug/ml
정도로 처리한다고 하지만 경험적으로는 조금 과량 넣어주는 것이 좋은 것 같습니다.

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RNase A를 넣었을 경우에는 37°C에서 30분 정도 처리합니다. 그 다음 RNaseA를 포함해서 남아있는 단백질들을 제거해야 합니다.
이렇게 RNA와 단백질을 제거하지 않으면 나중에 제한효소 처리나 sequencing 반응이 제대로 되지 않습니다.

단백질를 없애는 것은 phenol 처리로 합니다. 사용하는 시약은 phenol/chloroform/isoamyl alcohol이
25:24:1(v/v/v)로 섞인 것입니다. 이런 비교적 간단한 시약들은 물론 파는 것을 사도 되지만 직접 만들어 쓸 수도 있습니다. 단지
중요한 것은 phenol이란 시약은 TE, pH 8.0으로 saturation이 되어 있는 시약이라야 한다는 것입니다.

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같은 양의 이 시약을 넣고 vortex로 섞으면 사진처럼 전체가 뿌옇게 변합니다. 이렇게 되면 DNA 용액 속에 있던 단백질이
phenol과 접촉하면서 모두 변성됩니다. 변성된 단백질은 수용액에 녹지 않으므로 뿌옇게 침전됩니다.

이를 원심분리하면 위아래로 두 층으로 나뉩니다. 위 층이 aqueous phase, 즉 수용액으로서 DNA가 녹아있는 층이며, 아래 층이
organic phase로 유기용매층입니다. 변성된 단백질 찌거기가 두 층 사이(interphase)에 보이게 되므로, 이것이 딸려오지 않도록
상층액을 조심스럽게 떠서 새 tube에 옮깁니다.

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상층액에 3 M sodium acetate, pH 5.2 용액을 1/10 부피로, ethanol을 2.5 부피로 첨가하고 -20°C나
-70°C에서 20분 이상 둡니다. 이 용액 속에서 핵산은 상당히 안정하기 때문에 DNA나 RNA를 오래 보관하고 싶으면 이런 상태로
두기도 합니다. Sodium acetate 용액의 pH는 5.2 짜리를 많이 써 왔는데, 최근에 나오는 책에는 이보다 높은 것을 사용하라고 되어
있기도 합니다. Ethanol은 품질이 좋은 Merck 사 제품을 쓰는 것이 좋습니다. 이 에탄올은 absolute ethanol이라 하며,
-20°C에 보관하도록 합니다.

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이를 원심분리하여 침전물을 얻습니다.

사진에는 나타내지 않았지만, 침전물에 70% ethanol을 약 500 ul 넣고 다시 원심분리하여 제거하면 더욱 정제된 DNA 를 얻을
수 있습니다. 이를 "washing step"이라 하고 반드시 사용하는 것이 좋습니다.

침전된 순수한 DNA를 TE, pH 8.0 용액에 녹입니다. TE, pH 8.0 용액은 Tris-Cl, pH 8.0 용액이 10 mM,
EDTA, pH 8.0 용액이 1 또는 0.1 mM로 되어 있는 용액입니다. DNA 는 이름 그대로 산(acid)이기 때문에 수용액에 있으면
조금씩 pH가 낮아져 DNA가 손상된다고 하므로, 위와 같이 tris buffer를 넣어줍니다. 또한 DNA를 변형시키는 효소들은
magnesium과 같은 2가 이온을 필요로 하므로 EDTA 를 조금 넣어주면 이런 효소들로부터 DNA를 보호할 수 있습니다.

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DNA가 눈에 보이기도 하고 양이 적으면 잘 보이지 않기도 합니다. 그러나 상당히 순수한 plasmid DNA가 분리되었습니다.

Supercoiled(closed circular) DNA와 open circular
DNA

분리한 DNA를 그대로 전기영동하면 사진과 같은 결과를 얻을 수 있습니다. 분리가 아주 잘 되면 대부분 supercoiled form
DNA만 보이지만 분리과정에서 작은 충격을 입어서 open circular form이 조금 나타날 수도 있습니다.

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보통 DNA는 그림과 같이 supercoiled form으로 존재하지만, 한 쪽 strand에 nick이 생기면 supercoil이
풀어져서 open circular form이 됩니다.

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실제로 같은 DNA가 supercoiled, linear, open circular form으로 존재할 수 있는데, 이들을 전기영동하면
같은 염기서열의 같은 크기 DNA라도 이동하는 거리가 제각기 다릅니다. Size marker로 쓰는 짧은 DNA는 linear form입니다.
이렇게 전기영동으로 size를 비교할 수 있는 DNA는 linear form DNA 뿐입니다.

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이렇게 plasmid DNA를 분리하였습니다. 그냥 전기영동해서는 이게 원하는 DNA인지 알기 힘들고, 제한효소 mapping과 DNA
sequencing을 한번 해 봅시다.