생리생화학실험실

Plasmid는 크게 다음과 같은 세 부분으로 구성되어 있습니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_04_plasmid_component.gif"
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1) Replication origin

이 부분은 plasmid가 자가복제할 때 처음 인식하는 부위이므로 모든 plasmid에 꼭 필요한 부분입니다. 그림에서 보이는 ColE1
ori라고 씌여진 부분입니다.
다른 곳에서 설명할 기회가 없을 것 같아 여기에서 설명하는데, f1(+) origin이라는 것이
보이지요  이것은 사실 plasmid의 origin of replication이 아니라 bacteriophage의 origin입니다.
이걸 여기에 삽입해 놓으면 이 plasmid가 때로는 bacteriophage처럼 행동하기도 합니다. Bacteriophage의 장점은 life
cycle 중에서 single stranded DNA로 존재할 때가 있다는 것인데, 이런 성질이 유용할 때가 있습니다. 어느 쪽 strand가
single strand 상태로 존재하는가에 따라 f1(+) 혹은 f1(-) origin을 이용합니다.

2) Antibiotics resistance gene

이것은 항생제에 내성을 나타내는 유전자입니다. 대개는 ampicillin resistance gene이 들어 있는데, 이 경우 여기서
나오는 단백질은 그 유명한 beta-lactamase입니다. Amp^R이라고 씁니다. 때로는 kanamycin
resistance gene을 쓰기도 하고, eukaryote expression vector에는 주로 neomycin resistance
gene이 들어 있습니다.

3) Multiple cloning site(MCS)와 LacZ'

이 부위는 제한효소로 잘릴 수 있는 부위를 한꺼번에 모아놓은 부분입니다. 제한효소로 잘라서 다른 DNA를 삽입시킬 때 위에서 설명한 중요한
부분들이 같이 잘리면 곤란하겠지요. 그래서 다른 부분은 절대 잘리지 않고 이 부분에만 잘릴 수 있도록 열 몇가지 제한효소 절단부위를 인위적으로
조작해 놓은 것입니다. 이 MCS 부위는 길어야 100 - 150 bp 정도이며 앞 뒤 부분에 SP6, T3, T7 promoter 등이
붙어있게 됩니다. 이런 부위는 RNA를 시험관에서 만들거나 단백질 발현을 시킬 때, 그리고 DNA sequencing 같은 실험을 할
때 쓰이는 부위입니다. 여기에 써 있는 제한효소는 실험실에서 고추장 된장 간장 등에 해당하는 것으로 이름을 반드시 알아야 하겠습니다.
때로는 절단부위까지도 대개 외우고 있게 됩니다.

LacZ'는 꼭 필요한 것은 아니지만 대개는 있으며 반드시 MCS(multiple cloning site)를 포함하고 있습니다. 이 부분에
대해서는 나중에 자세히 설명하겠습니다.

항생제를 이용한 selection

Transformation한 후의 결과는 다음 세 가지 중의 하나로 생각할 수 있습니다.

1) Plasmid가 들어가지 않은 경우
2) Plasmid가 들어갔으나 plasmid에 원하는 gene이 들어가지 않은
경우
3) 원하는 gene이 포함된 plasmid가 들어간 경우

Plasmid에는 antibiotics resistance gene이 포함되어 있으므로 항생제가 포함된 배양접시에서 plasmid가
들어가지 않은 cell은 사멸하여 colony를 생성하지 못합니다. 배양접시에 보이는 colony는 모두 plasmid가 들어가 있는
cell입니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_04_ampicillin.gif" width=440
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아무리 transformation 효율을 높인다고 하여도 competent cell 중에서 DNA가 들어간 균은 아주 적습니다. 그러므로
이것들이 모두 colony를 형성한다면 그건 정말 끔찍한 일입니다. 그만큼 항생제를 이용하는 것은 옵션이 아닌 필수적인 것입니다.

그렇지만 이것으로 문제가 모두 해결되는 것은 아닙니다. 재조합 plasmid에 원하는 gene이 제대로 들어가 있는지 확인할 필요가
있습니다. 재조합되지 않은 그냥 plasmid가 cell 내에 들어가 있을 수도 있기 때문입니다. 위 그림에서 두번째와 세번째를 구분하는 것이
바로 다음에 설명할 LacZ를 이용한 color selection입니다.

LacZ를 이용한 color selection

LacZ를 이해하기 위해서는 Lac operon이란 것을 알아야 합니다. 이는 박테리아에서 시행되는 유전자 발현 조절 기구입니다.

Lac operon은 E. coli가 lactose를 galactose와 glucose로 분해하는데 필요한 효소인
beta-galactosidase를 만드는 유전자입니다. 다음은 Lac operon이 동작하는 얼개입니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_04_lac_operon.gif" width=534
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Lactose가 없을 때에는 불필요한 유전자인 beta-galactosidase는 생성되지 않습니다. 그 이유는 유전자의 앞쪽에 있는
inhibitor region에서 생성된 inhibitor가 promotor 영역의 operator 부분에 결합하여 RNA polymerase
가 활동하는 것을 방해하여 beta-galactosidase가 생성되지 않도록 하기 때문입니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_04_lac_operon_on_off.gif"
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그러나 lactose가 배지에 있으면 이 물질이 inhibitor와 결합하여 operator에서 떼어냅니다. 따라서 RNA
polymerase가 잘 작용하여 mRNA를 만들고, beta-galatosidase를 만들면서 lactose를 분해합니다. 그 후
lactose가 다 분해되면 inhibitor가 다시 붙어 유전자는 turn off 될 것입니다.

이런 유전자 조절 기구를 실험에 이용하고자 하는 것이 바로 LacZ입니다. 이 부분을 plasmid에 삽입해 놓게 되는데, 이때 LacZ
operon이 동작하고 있는가 확인하기 위해서는 IPTG와 X-Gal이라는 두 가지 물질을 사용합니다.

• IPTG는 LacZ gene inducer역할을 합니다. Lactose 대신
  inhibitor와 결합하지만 분해되지 않습니다.
  
• color=maroon>X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside)은
  lactose 대신 beta-galactosidase에 의하여 대사되는 물질입니다. 일종의 변형된 galactose sugar로서 원래
  무색이지만 beta-galactosidase에 의하여 대사되면 푸른색을 냅니다.

따라서 LacZ의 MCS에 DNA가 재조합되지 않은 박테리아의 colony는 LacZ가 제기능을 발휘하여 X-Gal을 대사시키므로 푸른
색이 되고, DNA가 재조합된 박테리아의 conony는 LacZ가 망가져서 기능하지 않아 X-Gal이 그대로 남아 있어서 흰색 colony가
됩니다. 이렇게 색깔의 차이로 DNA가 plasmid 에 들어가서 세포 내에서 증폭되어 기능하는지 알 수 있습니다. 아래 그림을 보면서
이해하시기 바랍니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_04_lacz_function.gif" width=574
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그림에서 설명이 되듯이 plasmid에 들어가 있는 lacZ는 Lac operon의 일부입니다. Lac operon은 너무 커서
plasmid에 다 넣으면 못씁니다. 그래서 plasmid에서 작은 부분(alpha fragment)을 만들고, E. coli에서 나머지
부분(omega fragment)을 만들어 보완하면 완전한 beta galactosidase의 기능을 할 수 있게 됩니다. 이를 alpha
complementation이라고 합니다.

사실, E. coli는 원래 beta galactosidase를 만들 수 있는 유전자를 가지고 있는 미생물입니다. 그러므로 정상적인
균이라면 plasmid가 들어가지 않아도 blue colony를 형성해야 하겠지요. 그래서 실험실에서 사용하는 균주는 거의가 Lac
operon이 망가진, 위와 같이 omega fragment만을 만들 수 있는 mutant를 사용하는 것입니다.

Selection의 결과

지금까지의 과정을 정리하면 다음과 같습니다. Ampicillin과 X-Gal/IPTG시약으로 원하는 세포를 고르는 과정입니다.

Ampicllin 처리에 colony를 형성한 것 중에서 X-Gal/IPTG 처리로 흰색을 보이는 colony가 원하는 gene이
plamid에 재조합되어 들어가 있는 cell인 것입니다. 좀 복잡합니까  이는 참으로 천재적인 발상인 것 같습니다. LacZ를
넣으면서 유전부호를 조작하여 multiple cloning site를 만든 것을 생각해보십시오.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_04_summary.gif" width=508
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Transformation process

LacZ를 이용하여 재조합 plasmid가 들어간 colony를 선택하기 위해서는 그림처럼 배양 접시에 X-Gal과 IPTG 시약을 넓게
바른 후 그 위에 세포를 골고루 펴서 발라줍니다. X-gal은 빛을 받으면 못쓰게 되므로 배지에 직접 첨가하는 방법은 그다지 좋지 못합니다.

src="http://dkbiophysi.pulun.net/transformation_06_spread.gif" width=445
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Spreading을 하고 있는 장면입니다. 삼각 밀대를 어떻게 만드느냐고 묻는 사람이 많은데, 유리봉을 달구어 굽혀서 만듭니다. 실험실에서
별거 다하지요  쇠로 된 걸 팔기도 합니다.

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이렇게 해서 37°C 배양기에서 뒤집어 밤새 키우면 아래와 같은 결과를 얻을 수 있습니다.
왼쪽의 plate를 확대한 것이 오른쪽의
사진입니다. 약간 투명하게 보일 수도 있긴 하지만 이것은 아무래도 플래쉬를 터뜨린 결과인 것 같습니다.

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덤으로 보여드리겠습니다. E. coli의 실물사진입니다. 요놈 덕분에 많은 일을 할 수 있게 되었죠.

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